Nghiên cứu ứng dụng bức xạ ion hóa kết hợp công nghệ Ribosome cải thiện khả năng sinh Protease của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

Tóm tắt: Bacillus subtilis B5 là chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease cao được tuyển chọn từ một số phòng thí nghiệm trong nước. Huyền phù dịch tế bào ở giai đoạn phát triển theo hàm mũ và đĩa thạch dinh dưỡng có cấy tế bào của chủng vi khuẩn này được xử lý chiếu xạ ở dải liều 0-3000 Gy trên nguồn Co-60 tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội. Kết quả cho thấy tỷ lệ vi khuẩn sống sót đều giảm theo liều và đường cong sống sót của chúng dường như tuân theo lý thuyết mô hình truyền năng lượng. Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ liều khác nhau tới khả năng kháng streptomycin (20 μg/ml) của chủng Bacillus subtilis B5 cũng được khảo sát. Tần số đột biến kháng streptomycin của chủng vi khuẩn này tăng đáng kể nhờ xử lý chiếu xạ. Tần số đột biến cao nhất là 1,61×10-3 (621 CFU thu được 1 đột biến) khi xử lý chiếu xạ liều 1000 Gy, tần số đột biến thấp hơn khoảng 3,09×10-6 (0,323×106 CFU thu được 1 đột biến) khi chiếu xạ liều 100 Gy. Trong khi đó, số liệu cho thấy tần số đột biến kháng streptomycin tự nhiên trung bình là 1,7810-6 (0,56106 CFU thu được 1 đột biến).
Sau lần sàng lọc đầu tiên, 25 khuẩn lạc kháng streptomycin 20 μg/ml có khả năng sinh protease cao hơn chủng thuần được lựa chọn từ 361 khuẩn lạc Bacillus subtilis B5 kháng xạ. Trong các lần sàng lọc tiếp theo, bằng cách tăng dần nồng độ kháng sinh (KS) trong môi trường nuối cấy đã thu được 6 khuẩn lạc kháng xạ, kháng KS có khả năng sinh protease vượt trội so với các chủng gốc ban đầu. Kết quả xác định trình tự gen rpoB và rspL của 6 khuẩn lạc Bacillus cho thấy 3/6 khuẩn lạc có gen rpoB mang đột biến, không có bất kì đột biến nào trên gen rpsL được phát hiện, chứng tỏ tính kháng streptomycin do đột biến ở gen rpoB và liên quan đến khả năng tăng sinh tổng hợp protease, phù hợp với các công bố quốc tế trước đây. Trong số các đột biến thì dòng 609 (tạo được nhờ chiếu xạ liều 500 Gy kết hợp xử lý streptomycin 200 μg/ml) có khả năng sinh protease vượt trội (cao hơn 2,7 lần so với chủng gốc) và ổn định so với các đột biến còn lại.
Sử dụng phương pháp mô hình hóa đáp ứng bề mặt – thiết kế tại tâm (RSM – CCD) kết hợp với phần mềm tin sinh Design Expert và kiểm tra bằng thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu của bốn yếu tố trong nuôi cấy dòng đột biến Bacillus subtilis-609 thu protease cực đại là 2299,49 UI/ml ở các giá trị hàm lượng pepton 6,5 g/l, hàm lượng cao thịt 2 g/l, pH 7,16, thời gian nuôi cấy là 21 giờ. Tiến hành thí nghiệm với các giá trị dự đoán, hoạt độ protease nhận được từ kết quả thực nghiệm là 2257,32 UI/ml.
Từ khóa: Bacillus subtilis, chiếu xa gamma, protease, streptomycin, tỷ lệ sống sót, tần số đột biến